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二胺氧化酶,可见分光光度法,试剂盒 |
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二胺氧化酶(DAO)试剂盒可见分光光度法说明书
可见分光光度法 50管/24样
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
商品属性:
产品名称:二胺氧化酶(DAO)试剂盒可见分光光度法
货号:LZ-S0161-A
规格 : 50管/24样
测试方法:可见分光光度法
产品分类:氧化与抗氧化系列
发货地:上海
测定意义:
DAO(EC1.4.3.6)广泛存在于动物(肠粘膜、肺、肝脏、肾脏等)、植物和微生物中。催化多胺氧化为醛,其活性与核酸和蛋白合成密切相关,能够反映肠道机械屏障的完整性和受损伤程度。
测定原理:
DAO催化尸胺产生醛和过氧化氢,外源添加过量的辣根过氧化物酶,催化过氧化氢氧化邻联茴香胺生成有色物质,在460nm处有特征吸收峰,通过测定该波长吸光度增加速率,计算DAO活性。
需自备的仪器和用品:
天平、低温离心机、可见分光光度计、1 mL玻璃比色皿、蒸馏水。
生化检测试剂盒操作步骤:
一、准备工具和环境:确保操作台面干净、整洁,这是进行科学实验的步。
二、仔细阅读说明书:这是使用试剂盒的基础,说明书包含了所有必要的信息和操作指南。
三、样本采集:按照说明书的指导,正确采集样本。不同类型的检测可能需要不同类型的样本,如血液、唾液或鼻涕等。
四、样本混合:将样本与试剂小心混合,注意轻柔操作,避免产生泡沫,以确保检测的准确性。
五、等待反应:混合后,耐心等待试剂盒的反应,这个时间可以用来进行其他活动,但不要着急,因为好的结果值得等待。
六、结果判读:时间到后,仔细判读结果。试剂盒通常会有明确的指示,告诉你如何根据显示的线条或颜色来判断结果。
NAD+和 NADH 的提取:
1 血清(浆)中 NAD+和 NADH 的提取NAD+的提取:按照血清(浆)体积(mL):酸性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约 0.1mL 血清(浆),加入 1mL 酸性提取液),60℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。NADH 的提取:按照血清(浆)体积(mL):碱性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约 0.1mL 血清(浆),加入 1mL 碱性提取液),60℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2 组织中 NAD+和 NADH 的提取:NAD+的提取:按照组织质量(g):酸性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约 0.1g组织,加入 1mL 酸性提取液),冰浴研磨,60℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
NADH 的提取:按照组织质量(g):碱性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约 0.1g
组织,加入 1mL 碱性提取液),冰浴研磨,60℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
3 细胞或细菌中 NAD+和 NADH 的提取:NAD+的提取:先收集细胞或细菌到离心管内,弃上清,按照细菌或细胞数量(104个):酸性提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 酸性提取液),超声波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次),60℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。NADH 的提取:先收集细胞或细菌到离心管内,弃上清,按照细菌或细胞数量(104个):碱性提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 碱性提取液),超声波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次),60℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
注意事项:
①加入试剂的顺序应一致,以所有反应板孔温育的时间一样。
②使用干净的塑料容器配置洗涤液。
③按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。
④底物A应挥发,避免长时间打开盖子。底物B对光敏感,避免长时间暴露于光下。避免用手接触,有毒。实验完成后应立即读取OD值。
⑤洗涤酶标板时应充分拍干,不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。
⑥使用一次性的吸头以免交叉污染,吸取终止液和底物A、B液时,避免使用带金属部分的加样器 。
⑦实验中不用的板条应立即放回包装袋中,密封保存,以免变质。
⑧试剂应按标签说明书储存,使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃,不可保存。
⑨不用的其它试剂应包装好或盖好。
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